激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計算機、激光和圖像處理技術獲得生物樣品三維數據、目前*的分子細胞生物學的分析儀器。主要用于觀察活細胞結構及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等。

 

傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖象都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾。激光共聚焦顯微鏡利用激光束經照明針孔形成點光源對標本內焦平面上的每一點掃描標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管( PM T)或冷電耦器件( cCCD)逐點或逐線接收，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖象。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像。這樣得到的共聚焦圖象是標本的光學橫斷面，克服了普通顯微鏡圖象模糊的缺點。

 

與傳統(tǒng)顯微鏡相比，激光激光激光共聚焦顯微鏡具有高分辨率，高靈敏度和高放大倍率。隨著軟件開發(fā)和應用技術的發(fā)展，激光激光激光共聚焦顯微鏡已成為形態(tài)學，分子細胞生物學，神經科學，藥理學和遺傳學領域的新一代強大的研究工具。

 

激光共聚焦顯微鏡的操作步驟：

 

1、根據熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長選擇合適的激光，激光功率，光譜濾光片和發(fā)射濾光片。

2、確定掃描方法：點，線，面，3D掃描。

3、確定掃描密度（分辨率）：256×256,512×512,1024×1024,2048×2048，分辨率越高，掃描速度越慢，圖像信噪比越好，但越多可能會發(fā)生光漂白。

4、選擇共焦顯微鏡物鏡的倍數和電子放大倍率：確定此條件后，確定掃描范圍，物鏡的透光率與數值孔徑（NA）的四次方成正比，并且物鏡放大倍數的平方。因此，反比例，應盡可能選擇具有高數值孔徑的物鏡。

5、根據樣品的制備質量，選擇合適的針孔尺寸，調節(jié)激光管電壓，光電倍增管功率，降噪等，達到最佳狀態(tài)。這些參數的選擇或設置非常緊密，應該全面考慮。

6、確定光線切割范圍，即掃描樣品的厚度，起始位置和結束位置。

7、給出了由光切割的層數和拍攝時的累積平均次數。

8、獲取圖像并保存。